Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt mới hơn (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Việc thiết lập mô hình động vật về biến đổi Modic (MC) là cơ sở quan trọng để nghiên cứu MC. Năm mươi bốn con thỏ trắng New Zealand được chia thành nhóm phẫu thuật giả, nhóm cấy ghép cơ (nhóm ME) và nhóm cấy ghép nhân tủy (nhóm NPE). Trong nhóm NPE, đĩa đệm được bộc lộ bằng phương pháp phẫu thuật thắt lưng trước bên và dùng kim chọc thủng thân đốt sống L5 gần tấm cuối. Nhân tủy được lấy từ đĩa đệm L1/2 bằng ống tiêm và tiêm vào đó. Khoan một lỗ trên xương dưới sụn. Các thủ thuật phẫu thuật và phương pháp khoan trong nhóm cấy ghép cơ và nhóm phẫu thuật giả giống với nhóm cấy ghép nhân tủy. Trong nhóm ME, một mảnh cơ được đặt vào lỗ, trong khi ở nhóm phẫu thuật giả, không có gì được đặt vào lỗ. Sau phẫu thuật, tiến hành chụp cộng hưởng từ (MRI) và xét nghiệm sinh học phân tử. Tín hiệu trong nhóm NPE thay đổi, nhưng không có sự thay đổi tín hiệu rõ rệt trong nhóm phẫu thuật giả và nhóm ME. Quan sát mô học cho thấy sự tăng sinh mô bất thường được ghi nhận tại vị trí cấy ghép, và sự biểu hiện của IL-4, IL-17 và IFN-γ tăng lên trong nhóm NPE. Việc cấy ghép NP vào xương dưới sụn có thể tạo thành mô hình động vật của bệnh MC.
Tổn thương Modic (MC) là những tổn thương ở các tấm tận cùng đốt sống và tủy xương liền kề, có thể nhìn thấy trên hình ảnh cộng hưởng từ (MRI). Chúng khá phổ biến ở những người có các triệu chứng liên quan1. Nhiều nghiên cứu đã nhấn mạnh tầm quan trọng của MC do mối liên hệ của nó với đau lưng dưới (LBP)2,3. De Roos và cộng sự4 và Modic và cộng sự5 lần đầu tiên mô tả độc lập ba loại bất thường tín hiệu dưới sụn khác nhau trong tủy xương đốt sống. Tổn thương Modic loại I có cường độ tín hiệu thấp trên chuỗi xung T1W và cường độ tín hiệu cao trên chuỗi xung T2W. Tổn thương này cho thấy các tấm tận cùng bị nứt và mô hạt mạch máu liền kề trong tủy xương. Tổn thương Modic loại II cho thấy tín hiệu cao trên cả chuỗi xung T1W và T2W. Trong loại tổn thương này, có thể tìm thấy sự phá hủy tấm tận cùng, cũng như sự thay thế mỡ về mặt mô học của tủy xương liền kề. Tổn thương Modic loại III cho thấy tín hiệu thấp trên cả chuỗi xung T1W và T2W. Các tổn thương xơ cứng tương ứng với các tấm tận cùng đã được quan sát thấy6. MC được coi là một bệnh lý của cột sống và có liên quan chặt chẽ với nhiều bệnh thoái hóa cột sống7,8,9.
Dựa trên các dữ liệu hiện có, một số nghiên cứu đã cung cấp những hiểu biết chi tiết về nguyên nhân và cơ chế bệnh lý của MC. Albert và cộng sự cho rằng MC có thể do thoát vị đĩa đệm gây ra8. Hu và cộng sự cho rằng MC là do thoái hóa đĩa đệm nghiêm trọng10. Kroc đề xuất khái niệm “vỡ đĩa đệm bên trong”, cho rằng chấn thương đĩa đệm lặp đi lặp lại có thể dẫn đến các vết rách nhỏ ở tấm tận cùng. Sau khi hình thành khe hở, sự phá hủy tấm tận cùng bởi nhân tủy (NP) có thể kích hoạt phản ứng tự miễn dịch, dẫn đến sự phát triển của MC11. Ma và cộng sự có quan điểm tương tự và báo cáo rằng phản ứng tự miễn dịch do NP gây ra đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của MC12.
Các tế bào hệ miễn dịch, đặc biệt là tế bào lympho T hỗ trợ CD4+, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh tự miễn dịch13. Phân nhóm Th17 mới được phát hiện sản sinh ra cytokine gây viêm IL-17, thúc đẩy biểu hiện chemokine và kích thích các tế bào T trong các cơ quan bị tổn thương sản sinh ra IFN-γ14. Tế bào Th2 cũng đóng vai trò độc đáo trong cơ chế bệnh sinh của các phản ứng miễn dịch. Biểu hiện IL-4 như một tế bào Th2 tiêu biểu có thể dẫn đến những hậu quả bệnh lý miễn dịch nghiêm trọng15.
Mặc dù nhiều nghiên cứu lâm sàng đã được tiến hành trên MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, nhưng vẫn còn thiếu các mô hình thực nghiệm trên động vật phù hợp có thể mô phỏng quá trình MC thường xảy ra ở người và có thể được sử dụng để nghiên cứu nguyên nhân hoặc các phương pháp điều trị mới như liệu pháp nhắm mục tiêu. Cho đến nay, chỉ có một vài mô hình động vật về MC được báo cáo để nghiên cứu các cơ chế bệnh lý tiềm ẩn.
Dựa trên lý thuyết tự miễn dịch do Albert và Ma đề xuất, nghiên cứu này đã thiết lập một mô hình MC thỏ đơn giản và có thể tái tạo bằng cách tự cấy ghép NP gần đầu xương sống đã được khoan. Các mục tiêu khác là quan sát các đặc điểm mô học của mô hình động vật và đánh giá các cơ chế cụ thể của NP trong sự phát triển của MC. Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi sử dụng các kỹ thuật như sinh học phân tử, MRI và nghiên cứu mô học để nghiên cứu sự tiến triển của MC.
Hai con thỏ chết vì mất máu trong quá trình phẫu thuật, và bốn con thỏ chết trong khi gây mê trong lúc chụp MRI. 48 con thỏ còn lại sống sót và không có dấu hiệu bất thường về hành vi hoặc thần kinh sau phẫu thuật.
Kết quả chụp MRI cho thấy cường độ tín hiệu của mô được cấy ghép ở các lỗ khác nhau là khác nhau. Cường độ tín hiệu của thân đốt sống L5 trong nhóm NPE thay đổi dần ở các thời điểm 12, 16 và 20 tuần sau khi cấy ghép (chuỗi xung T1W cho thấy tín hiệu thấp, và chuỗi xung T2W cho thấy tín hiệu hỗn hợp cộng với tín hiệu thấp) (Hình 1C), trong khi hình ảnh MRI của hai nhóm mô được cấy ghép còn lại tương đối ổn định trong cùng thời gian đó (Hình 1A, B).
(A) Hình ảnh cộng hưởng từ (MRI) đại diện theo trình tự của cột sống thắt lưng thỏ tại 3 thời điểm khác nhau. Không phát hiện bất thường tín hiệu nào trong hình ảnh của nhóm phẫu thuật giả. (B) Đặc điểm tín hiệu của thân đốt sống trong nhóm ME tương tự như trong nhóm phẫu thuật giả, và không quan sát thấy sự thay đổi tín hiệu đáng kể nào tại vị trí cấy ghép theo thời gian. (C) Trong nhóm NPE, tín hiệu thấp được nhìn thấy rõ ràng trong chuỗi T1W, và tín hiệu hỗn hợp cùng tín hiệu thấp được nhìn thấy rõ ràng trong chuỗi T2W. Từ tuần thứ 12 đến tuần thứ 20, các tín hiệu cao rải rác xung quanh các tín hiệu thấp trong chuỗi T2W giảm dần.
Có thể thấy rõ hiện tượng tăng sinh xương tại vị trí cấy ghép thân đốt sống ở nhóm NPE, và hiện tượng tăng sinh xương này diễn ra nhanh hơn từ 12 đến 20 tuần (Hình 2C). So với nhóm NPE, không có sự thay đổi đáng kể nào được quan sát thấy ở thân đốt sống được mô phỏng; nhóm giả dược và nhóm ME (Hình 2C) 2A,B).
(A) Bề mặt thân đốt sống tại vị trí cấy ghép rất nhẵn, lỗ lành tốt và không có hiện tượng tăng sinh xương ở thân đốt sống. (B) Hình dạng vị trí cấy ghép ở nhóm ME tương tự như ở nhóm phẫu thuật giả, và không có sự thay đổi rõ rệt về hình dạng vị trí cấy ghép theo thời gian. (C) Hiện tượng tăng sinh xương xảy ra tại vị trí cấy ghép ở nhóm NPE. Sự tăng sinh xương diễn ra nhanh chóng và thậm chí lan rộng qua đĩa đệm liên đốt sống đến thân đốt sống đối diện.
Phân tích mô học cung cấp thông tin chi tiết hơn về quá trình hình thành xương. Hình 3 cho thấy hình ảnh các lát cắt sau phẫu thuật được nhuộm bằng H&E. Trong nhóm phẫu thuật giả, các tế bào sụn được sắp xếp tốt và không phát hiện thấy sự tăng sinh tế bào (Hình 3A). Tình hình ở nhóm ME tương tự như ở nhóm phẫu thuật giả (Hình 3B). Tuy nhiên, trong nhóm NPE, một lượng lớn tế bào sụn và sự tăng sinh của các tế bào giống NP được quan sát thấy tại vị trí cấy ghép (Hình 3C);
(A) Có thể thấy các bè xương gần tấm cuối, các tế bào sụn được sắp xếp gọn gàng với kích thước và hình dạng tế bào đồng nhất và không có sự tăng sinh (40 lần). (B) Tình trạng vị trí cấy ghép ở nhóm ME tương tự như nhóm giả dược. Có thể thấy các bè xương và tế bào sụn, nhưng không có sự tăng sinh rõ rệt tại vị trí cấy ghép (40 lần). (B) Có thể thấy các tế bào sụn và tế bào giống NP tăng sinh đáng kể, và hình dạng và kích thước của các tế bào sụn không đồng đều (40 lần).
Sự biểu hiện của mRNA interleukin 4 (IL-4), mRNA interleukin 17 (IL-17) và mRNA interferon γ (IFN-γ) được quan sát thấy ở cả nhóm NPE và ME. Khi so sánh mức độ biểu hiện của các gen mục tiêu, sự biểu hiện gen của IL-4, IL-17 và IFN-γ tăng lên đáng kể ở nhóm NPE so với nhóm ME và nhóm phẫu thuật giả (Hình 4) (P < 0,05). So với nhóm phẫu thuật giả, mức độ biểu hiện của IL-4, IL-17 và IFN-γ ở nhóm ME chỉ tăng nhẹ và không đạt được sự thay đổi có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).
Mức độ biểu hiện mRNA của IL-4, IL-17 và IFN-γ ở nhóm NPE cho thấy xu hướng cao hơn đáng kể so với nhóm phẫu thuật giả và nhóm ME (P < 0,05).
Ngược lại, mức độ biểu hiện ở nhóm ME không cho thấy sự khác biệt đáng kể (P>0,05).
Phân tích Western blot được thực hiện bằng cách sử dụng các kháng thể có sẵn trên thị trường chống lại IL-4 và IL-17 để xác nhận mô hình biểu hiện mRNA bị thay đổi. Như thể hiện trong Hình 5A,B, so với nhóm ME và nhóm phẫu thuật giả, nồng độ protein của IL-4 và IL-17 trong nhóm NPE tăng lên đáng kể (P < 0,05). So với nhóm phẫu thuật giả, nồng độ protein của IL-4 và IL-17 trong nhóm ME cũng không đạt được sự thay đổi có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).
(A) Nồng độ protein IL-4 và IL-17 ở nhóm NPE cao hơn đáng kể so với nhóm ME và nhóm giả dược (P < 0,05). (B) Biểu đồ Western blot.
Do số lượng mẫu mô người thu được trong quá trình phẫu thuật còn hạn chế, việc nghiên cứu rõ ràng và chi tiết về cơ chế bệnh sinh của MC gặp nhiều khó khăn. Chúng tôi đã cố gắng thiết lập mô hình động vật mắc MC để nghiên cứu các cơ chế bệnh lý tiềm tàng của nó. Đồng thời, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp đánh giá hình ảnh học, mô học và sinh học phân tử để theo dõi diễn biến của MC do ghép tự thân NP gây ra. Kết quả cho thấy, mô hình cấy ghép NP dẫn đến sự thay đổi dần dần về cường độ tín hiệu từ tuần thứ 12 đến tuần thứ 20 (tín hiệu thấp hỗn hợp trong chuỗi T1W và tín hiệu thấp trong chuỗi T2W), cho thấy sự thay đổi mô, và các đánh giá mô học và sinh học phân tử đã xác nhận kết quả của nghiên cứu hình ảnh học.
Kết quả thí nghiệm này cho thấy những thay đổi về hình ảnh và mô học đã xảy ra tại vị trí tổn thương thân đốt sống ở nhóm NPE. Đồng thời, sự biểu hiện của các gen IL-4, IL-17 và IFN-γ, cũng như IL-4, IL-17 và IFN-γ đã được quan sát, cho thấy rằng sự xâm lấn mô nhân tủy tự thân vào thân đốt sống có thể gây ra một loạt các thay đổi về tín hiệu và hình thái. Dễ dàng nhận thấy rằng đặc điểm tín hiệu của thân đốt sống ở mô hình động vật (tín hiệu thấp trong chuỗi T1W, tín hiệu hỗn hợp và tín hiệu thấp trong chuỗi T2W) rất giống với đặc điểm của tế bào đốt sống người, và các đặc điểm MRI cũng xác nhận các quan sát về mô học và giải phẫu đại thể, tức là những thay đổi trong tế bào thân đốt sống là có tính chất tiến triển. Mặc dù phản ứng viêm do chấn thương cấp tính có thể xuất hiện ngay sau khi chọc kim, nhưng kết quả MRI cho thấy những thay đổi tín hiệu tăng dần xuất hiện 12 tuần sau khi chọc kim và kéo dài đến 20 tuần mà không có bất kỳ dấu hiệu phục hồi hoặc đảo ngược nào của các thay đổi MRI. Những kết quả này cho thấy rằng việc sử dụng NP đốt sống tự thân là một phương pháp đáng tin cậy để thiết lập MV tiến triển ở thỏ.
Mô hình chọc kim này đòi hỏi kỹ năng, thời gian và nỗ lực phẫu thuật thích hợp. Trong các thí nghiệm sơ bộ, việc bóc tách hoặc kích thích quá mức các cấu trúc dây chằng cạnh cột sống có thể dẫn đến hình thành gai xương cột sống. Cần thận trọng để không làm tổn thương hoặc kích thích các đĩa đệm liền kề. Vì độ sâu xuyên thấu phải được kiểm soát để có được kết quả nhất quán và có thể lặp lại, chúng tôi đã tự tạo một nút bịt bằng cách cắt bỏ vỏ của kim dài 3 mm. Sử dụng nút bịt này đảm bảo độ sâu khoan đồng đều trong thân đốt sống. Trong các thí nghiệm sơ bộ, ba bác sĩ phẫu thuật chỉnh hình tham gia ca mổ nhận thấy kim 16-gauge dễ sử dụng hơn kim 18-gauge hoặc các phương pháp khác. Để tránh chảy máu quá nhiều trong quá trình khoan, giữ kim cố định trong một thời gian sẽ tạo ra một lỗ chèn phù hợp hơn, cho thấy rằng một mức độ MC nhất định có thể được kiểm soát theo cách này.
Mặc dù nhiều nghiên cứu đã nhắm vào MC, nhưng vẫn còn ít thông tin về nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh của MC25,26,27. Dựa trên các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi nhận thấy rằng tự miễn dịch đóng vai trò quan trọng trong sự xuất hiện và phát triển của MC12. Nghiên cứu này đã kiểm tra sự biểu hiện định lượng của IL-4, IL-17 và IFN-γ, là các con đường biệt hóa chính của tế bào CD4+ sau khi kích thích kháng nguyên. Trong nghiên cứu của chúng tôi, so với nhóm đối chứng âm tính, nhóm NPE có sự biểu hiện IL-4, IL-17 và IFN-γ cao hơn, và nồng độ protein của IL-4 và IL-17 cũng cao hơn.
Về mặt lâm sàng, biểu hiện mRNA của IL-17 tăng lên trong các tế bào NP từ bệnh nhân bị thoát vị đĩa đệm28. Mức độ biểu hiện IL-4 và IFN-γ tăng lên cũng được tìm thấy trong mô hình thoát vị đĩa đệm không do chèn ép cấp tính so với nhóm đối chứng khỏe mạnh29. IL-17 đóng vai trò quan trọng trong viêm nhiễm, tổn thương mô trong các bệnh tự miễn dịch30 và tăng cường phản ứng miễn dịch với IFN-γ31. Tổn thương mô do IL-17 gây ra đã được báo cáo ở chuột MRL/lpr32 và chuột dễ mắc bệnh tự miễn dịch33. IL-4 có thể ức chế biểu hiện của các cytokine gây viêm (như IL-1β và TNFα) và hoạt hóa đại thực bào34. Người ta báo cáo rằng biểu hiện mRNA của IL-4 khác nhau ở nhóm NPE so với IL-17 và IFN-γ ở cùng một thời điểm; biểu hiện mRNA của IFN-γ ở nhóm NPE cao hơn đáng kể so với các nhóm khác. Do đó, sản xuất IFN-γ có thể là chất trung gian của phản ứng viêm do sự xen kẽ NP gây ra. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng IFN-γ được sản xuất bởi nhiều loại tế bào, bao gồm tế bào T hỗ trợ loại 1 được hoạt hóa, tế bào sát thủ tự nhiên và đại thực bào35,36, và là một cytokine tiền viêm quan trọng thúc đẩy các phản ứng miễn dịch37.
Nghiên cứu này cho thấy phản ứng tự miễn dịch có thể liên quan đến sự xuất hiện và phát triển của MC. Luoma và cộng sự nhận thấy rằng đặc điểm tín hiệu của MC và NP nổi bật tương tự nhau trên MRI, và cả hai đều cho thấy tín hiệu cao trong chuỗi T2W38. Một số cytokine đã được xác nhận là có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện của MC, chẳng hạn như IL-139. Ma và cộng sự cho rằng sự nhô lên hoặc nhô xuống của NP có thể ảnh hưởng lớn đến sự xuất hiện và phát triển của MC12. Bobechko40 và Herzbein và cộng sự41 báo cáo rằng NP là một mô dung nạp miễn dịch không thể đi vào hệ tuần hoàn mạch máu từ khi sinh ra. Sự nhô ra của NP đưa các vật thể lạ vào nguồn cung cấp máu, do đó làm trung gian cho các phản ứng tự miễn dịch tại chỗ42. Các phản ứng tự miễn dịch có thể tạo ra một lượng lớn các yếu tố miễn dịch, và khi các yếu tố này liên tục tiếp xúc với các mô, chúng có thể gây ra những thay đổi trong tín hiệu43. Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện quá mức của IL-4, IL-17 và IFN-γ là các yếu tố miễn dịch điển hình, chứng minh thêm mối quan hệ chặt chẽ giữa NP và MC44. Mô hình động vật này mô phỏng tốt sự đột phá và xâm nhập của NP vào tấm tận cùng. Quá trình này càng làm sáng tỏ tác động của bệnh tự miễn dịch lên MC.
Đúng như dự đoán, mô hình động vật này cung cấp cho chúng ta một nền tảng khả thi để nghiên cứu MC. Tuy nhiên, mô hình này vẫn còn một số hạn chế: thứ nhất, trong giai đoạn quan sát động vật, một số con thỏ ở giai đoạn trung gian cần phải được gây chết để xét nghiệm mô học và sinh học phân tử, do đó một số động vật “không còn sử dụng được” theo thời gian. Thứ hai, mặc dù nghiên cứu này thiết lập ba mốc thời gian, nhưng thật không may, chúng ta chỉ mô hình hóa một loại MC (thay đổi Modic loại I), do đó chưa đủ để đại diện cho quá trình phát triển bệnh ở người, và cần phải thiết lập thêm nhiều mốc thời gian hơn để quan sát tốt hơn tất cả các thay đổi tín hiệu. Thứ ba, những thay đổi trong cấu trúc mô thực sự có thể được thể hiện rõ ràng bằng phương pháp nhuộm mô học, nhưng một số kỹ thuật chuyên biệt có thể tiết lộ tốt hơn những thay đổi vi cấu trúc trong mô hình này. Ví dụ, kính hiển vi ánh sáng phân cực đã được sử dụng để phân tích sự hình thành sụn sợi trong đĩa đệm liên đốt sống của thỏ45. Tác động lâu dài của NP lên MC và tấm tận cùng cần được nghiên cứu thêm.
Năm mươi bốn con thỏ trắng New Zealand đực (nặng khoảng 2,5-3 kg, tuổi 3-3,5 tháng) được chia ngẫu nhiên thành nhóm phẫu thuật giả, nhóm cấy ghép cơ (nhóm ME) và nhóm cấy ghép rễ thần kinh (nhóm NPE). Tất cả các quy trình thí nghiệm đều được Ủy ban Đạo đức Bệnh viện Thiên Tân phê duyệt, và các phương pháp thí nghiệm được thực hiện nghiêm ngặt theo các hướng dẫn đã được phê duyệt.
Một số cải tiến đã được thực hiện đối với kỹ thuật phẫu thuật của S. Sobajima 46. Mỗi con thỏ được đặt ở tư thế nằm nghiêng và bề mặt trước của năm đĩa đệm liên đốt sống thắt lưng (IVD) liên tiếp được bộc lộ bằng phương pháp tiếp cận sau phúc mạc bên. Mỗi con thỏ được gây mê toàn thân (20% urethane, 5 ml/kg qua tĩnh mạch tai). Một vết rạch da dọc được thực hiện từ mép dưới của xương sườn đến vành chậu, cách các cơ cạnh cột sống 2 cm về phía bụng. Cột sống trước bên phải từ L1 đến L6 được bộc lộ bằng cách bóc tách sắc bén và cùn các mô dưới da, mô sau phúc mạc và cơ bắp bên trên (Hình 6A). Mức đĩa đệm được xác định bằng cách sử dụng vành chậu làm mốc giải phẫu cho mức đĩa đệm L5-L6. Sử dụng kim chọc 16-gauge để khoan một lỗ gần tấm cuối của đốt sống L5 với độ sâu 3 mm (Hình 6B). Sử dụng ống tiêm 5 ml để hút nhân tủy tự thân trong đĩa đệm đốt sống L1-L2 (Hình 6C). Loại bỏ nhân tủy hoặc cơ theo yêu cầu của từng nhóm. Sau khi khoan sâu lỗ, khâu chỉ tự tiêu vào màng cân sâu, màng cân nông và da, cẩn thận không làm tổn thương mô màng xương của thân đốt sống trong quá trình phẫu thuật.
(A) Đĩa đệm L5–L6 được bộc lộ thông qua đường mổ sau phúc mạc bên. (B) Sử dụng kim 16-gauge để khoan một lỗ gần mỏm xương sống L5. (C) Thu hoạch các mô sợi cơ tự thân.
Bệnh nhân được gây mê toàn thân bằng dung dịch urethane 20% (5 ml/kg) tiêm qua tĩnh mạch tai, và chụp X-quang cột sống thắt lưng được lặp lại sau phẫu thuật 12, 16 và 20 tuần.
Thỏ được gây chết bằng cách tiêm bắp ketamine (25,0 mg/kg) và tiêm tĩnh mạch natri pentobarbital (1,2 g/kg) vào các thời điểm 12, 16 và 20 tuần sau phẫu thuật. Toàn bộ cột sống được lấy ra để phân tích mô học và phân tích thực nghiệm. Phương pháp phiên mã ngược định lượng (RT-qPCR) và Western blotting được sử dụng để phát hiện những thay đổi trong các yếu tố miễn dịch.
Các xét nghiệm MRI được thực hiện trên thỏ bằng máy cộng hưởng từ lâm sàng 3.0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) được trang bị bộ thu cuộn dây chi vuông góc. Thỏ được gây mê bằng urethane 20% (5 mL/kg) qua tĩnh mạch tai và sau đó được đặt nằm ngửa trong máy cộng hưởng từ với vùng thắt lưng được đặt ở trung tâm của cuộn dây bề mặt hình tròn đường kính 5 inch (GE Medical Systems). Hình ảnh định vị T2-weighted mặt phẳng coronal (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) được thu thập để xác định vị trí của đĩa đệm thắt lưng từ L3–L4 đến L5–L6. Các lát cắt T2-weighted mặt phẳng sagittal được thu thập với các thiết lập sau: chuỗi xung spin-echo nhanh với thời gian lặp lại (TR) là 2200 ms và thời gian vọng âm (TE) là 70 ms, ma trận; trường nhìn 260 và tám kích thích; độ dày cắt là 2 mm, khoảng cách là 0,2 mm.
Sau khi chụp bức ảnh cuối cùng và giết con thỏ cuối cùng, các đĩa giả, đĩa cấy ghép cơ và đĩa NP được lấy ra để kiểm tra mô học. Mô được cố định trong dung dịch formalin đệm trung tính 10% trong 1 tuần, khử khoáng bằng axit ethylenediaminetetraacetic và cắt lát bằng paraffin. Các khối mô được nhúng trong paraffin và cắt thành các lát cắt dọc (dày 5 μm) bằng máy cắt lát vi mô. Các lát cắt được nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H&E).
Sau khi thu thập đĩa đệm cột sống từ thỏ trong mỗi nhóm, tổng RNA được chiết xuất bằng cột UNIQ-10 (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Thượng Hải Sangon, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và hệ thống phiên mã ngược ImProm II (Promega Inc., Madison, WI, Hoa Kỳ). Quá trình phiên mã ngược được thực hiện.
RT-qPCR được thực hiện bằng máy Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., Hoa Kỳ) và SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thể tích phản ứng PCR là 20 μl, chứa 1,5 μl cDNA pha loãng và 0,2 μM mỗi primer. Các primer được thiết kế bằng phần mềm OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) và được sản xuất bởi Công ty TNHH Công nghệ sinh học Nanjing Golden Stewart (Trung Quốc) (Bảng 1). Các điều kiện chu kỳ nhiệt sau đây đã được sử dụng: bước hoạt hóa polymerase ban đầu ở 94°C trong 2 phút, sau đó 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ 15 giây ở 94°C để biến tính khuôn mẫu, gắn kết trong 1 phút ở 60°C, kéo dài và đo huỳnh quang. Phép đo được thực hiện trong 1 phút ở 72°C. Tất cả các mẫu đều được khuếch đại ba lần và giá trị trung bình được sử dụng cho phân tích RT-qPCR. Dữ liệu khuếch đại được phân tích bằng FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Mức độ biểu hiện gen IL-4, IL-17 và IFN-γ được chuẩn hóa so với gen đối chứng nội sinh (ACTB). Mức độ biểu hiện tương đối của mRNA mục tiêu được tính toán bằng phương pháp 2-ΔΔCT.
Tổng lượng protein được chiết xuất từ mô bằng máy đồng hóa mô trong dung dịch đệm ly giải RIPA (chứa hỗn hợp chất ức chế protease và phosphatase) và sau đó ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C để loại bỏ mảnh vụn mô. 50 microgam protein được nạp vào mỗi làn, tách bằng điện di SDS-PAGE 10%, sau đó chuyển sang màng PVDF. Quá trình chặn được thực hiện trong dung dịch sữa bột không béo 5% trong dung dịch muối đệm Tris (TBS) chứa 0,1% Tween 20 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Màng được ủ với kháng thể chính thỏ kháng decorin (pha loãng 1:200; Boster, Vũ Hán, Trung Quốc) (pha loãng 1:200; Bioss, Bắc Kinh, Trung Quốc) qua đêm ở 4°C và phản ứng vào ngày hôm sau; Sử dụng kháng thể thứ cấp (kháng thể dê chống immunoglobulin G của thỏ ở độ pha loãng 1:40.000) kết hợp với peroxidase cải ngựa (Boster, Vũ Hán, Trung Quốc) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Tín hiệu Western blot được phát hiện bằng sự tăng cường phát quang hóa học trên màng phát quang hóa học sau khi chiếu xạ tia X. Để phân tích định lượng mật độ, các blot được quét và định lượng bằng phần mềm BandScan và kết quả được biểu thị dưới dạng tỷ lệ giữa khả năng phản ứng miễn dịch của gen mục tiêu và khả năng phản ứng miễn dịch của tubulin.
Các phép tính thống kê được thực hiện bằng phần mềm SPSS 16.0 (SPSS, Hoa Kỳ). Dữ liệu thu thập trong nghiên cứu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (mean ± SD) và được phân tích bằng phương pháp phân tích phương sai một chiều lặp lại (ANOVA) để xác định sự khác biệt giữa hai nhóm. Giá trị P < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
Do đó, việc thiết lập mô hình động vật mắc bệnh MC bằng cách cấy ghép các hạt nano tự thân vào thân đốt sống và tiến hành quan sát giải phẫu vĩ mô, phân tích MRI, đánh giá mô học và phân tích sinh học phân tử có thể trở thành một công cụ quan trọng để đánh giá và hiểu các cơ chế của bệnh MC ở người và phát triển các biện pháp điều trị mới.
Cách trích dẫn bài báo này: Han, C. et al. Một mô hình động vật về những thay đổi Modic đã được thiết lập bằng cách cấy nhân tủy tự thân vào xương dưới sụn của cột sống thắt lưng. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., và Boos, N. Chụp cộng hưởng từ cột sống thắt lưng: tỷ lệ mắc thoát vị đĩa đệm và giữ lại đĩa đệm, chèn ép rễ thần kinh, bất thường tấm tận cùng và thoái hóa khớp liên mấu ở những người tình nguyện không có triệu chứng. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, và Leboeuf-Eed, K. Những thay đổi Modic và mối liên hệ của chúng với các phát hiện lâm sàng. Tạp chí Cột sống Châu Âu: ấn phẩm chính thức của Hiệp hội Cột sống Châu Âu, Hiệp hội Biến dạng Cột sống Châu Âu và Hiệp hội Nghiên cứu Cột sống Cổ Châu Âu 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Những thay đổi Modic ở các tấm tận cùng đốt sống thắt lưng: tỷ lệ mắc và mối liên hệ với đau lưng và đau thần kinh tọa ở nam công nhân trung niên. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., và Dalinka, M. Chụp cộng hưởng từ (MRI) các thay đổi tủy xương gần tấm cuối trong bệnh thoái hóa cột sống thắt lưng. AJR. Tạp chí X quang Hoa Kỳ 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, và Carter, JR Bệnh thoái hóa đĩa đệm: đánh giá những thay đổi tủy xương cột sống bằng MRI. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, và Carter, JR. Hình ảnh bệnh thoái hóa đĩa đệm. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Các yếu tố dự báo sự thay đổi tín hiệu tấm tận cùng đốt sống mới (Modic) trong dân số nói chung. Tạp chí Cột sống Châu Âu: Ấn phẩm chính thức của Hiệp hội Cột sống Châu Âu, Hiệp hội Biến dạng Cột sống Châu Âu và Hiệp hội Nghiên cứu Cột sống Cổ Châu Âu, Phân hội 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB và Mannisch, K. Thay đổi Modic sau thoát vị đĩa đệm thắt lưng. Tạp chí Cột sống Châu Âu: Ấn phẩm chính thức của Hiệp hội Cột sống Châu Âu, Hiệp hội Biến dạng Cột sống Châu Âu và Hiệp hội Nghiên cứu Cột sống Cổ Châu Âu 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., và Kaapa, E. Những thay đổi loại I theo phân loại Modic có thể dự đoán sự thoái hóa đĩa đệm biến dạng tiến triển nhanh: một nghiên cứu tiền cứu kéo dài 1 năm. Tạp chí Cột sống Châu Âu 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ và Fan, SW Thay đổi Modic: nguyên nhân có thể và sự đóng góp vào thoái hóa đĩa đệm thắt lưng. Giả thuyết Y học 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV. Rách đĩa đệm bên trong. Các vấn đề thoát vị đĩa đệm ở người trên 50 tuổi. Cột sống (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Thời gian đăng bài: 13/12/2024