Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS giới hạn. Để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt mới hơn (hoặc vô hiệu hóa chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không cần Styles và JavaScript.
Việc thiết lập các mô hình động vật thay đổi mô -đun (MC) là một cơ sở quan trọng để nghiên cứu MC. Năm mươi bốn con thỏ trắng New Zealand được chia thành nhóm hoạt động giả, nhóm cấy cơ bắp (Nhóm ME) và nhóm cấy nucleus pulposus (Nhóm NPE). Trong nhóm NPE, đĩa đệm được phơi bày bằng phương pháp phẫu thuật thắt lưng trước và kim được sử dụng để đâm thủng cơ thể đốt sống L5 gần tấm cuối. NP được chiết xuất từ đĩa intervertebral L1/2 bằng một ống tiêm và được tiêm vào nó. Khoan một lỗ trong xương dưới màng cứng. Các thủ tục phẫu thuật và phương pháp khoan trong nhóm cấy cơ bắp và nhóm hoạt động giả giống như các phương pháp trong nhóm cấy ghép NP. Trong nhóm ME, một mảnh cơ được đặt vào lỗ, trong khi trong nhóm hoạt động giả, không có gì được đặt vào lỗ. Sau khi phẫu thuật, quét MRI và thử nghiệm sinh học phân tử đã được thực hiện. Tín hiệu trong nhóm NPE đã thay đổi, nhưng không có sự thay đổi tín hiệu rõ ràng trong nhóm hoạt động giả và nhóm ME. Quan sát mô học cho thấy sự tăng sinh mô bất thường đã được quan sát thấy tại vị trí cấy ghép và biểu hiện của IL-4, IL-17 và IFN-được tăng lên trong nhóm NPE. Cấy NP vào xương dưới màng cứng có thể tạo thành một mô hình động vật của MC.
Thay đổi mô -đun (MC) là các tổn thương của các kết thúc đốt sống và tủy xương liền kề có thể nhìn thấy trên hình ảnh cộng hưởng từ (MRI). Chúng khá phổ biến ở những người có triệu chứng liên quan1. Nhiều nghiên cứu đã nhấn mạnh tầm quan trọng của MC do mối liên hệ của nó với đau thắt lưng (LBP) 2,3. De Roos et al.4 và Modic et al.5 lần đầu tiên mô tả độc lập ba loại bất thường tín hiệu dưới màng cứng khác nhau ở tủy xương đốt sống. Thay đổi loại I Modic là giảm điểm trên các chuỗi có trọng số T1 (T1W) và hyperintense trên các chuỗi T2 có trọng số T2 (T2W). Tổn thương này cho thấy các kết thúc khe nứt và mô hạt mạch máu liền kề trong tủy xương. Thay đổi loại II Modic cho thấy tín hiệu cao trên cả hai chuỗi T1W và T2W. Trong loại tổn thương này, sự phá hủy kết thúc có thể được tìm thấy, cũng như thay thế chất béo mô học của tủy xương liền kề. Thay đổi loại III Modic cho thấy tín hiệu thấp trong các chuỗi T1W và T2W. Các tổn thương xơ cứng tương ứng với các bản cuối đã được quan sát6. MC được coi là một bệnh bệnh lý của cột sống và có liên quan chặt chẽ với nhiều bệnh thoái hóa của cột sống7,8,9.
Xem xét dữ liệu có sẵn, một số nghiên cứu đã cung cấp những hiểu biết chi tiết về nguyên nhân và cơ chế bệnh lý của MC. Albert et al. đề nghị MC có thể được gây ra bởi thoát vị đĩa đệm8. Hu et al. do MC do thoái hóa đĩa nặng 10. Kroc đã đề xuất khái niệm vỡ đĩa nội bộ của người Viking, trong đó tuyên bố rằng chấn thương đĩa lặp đi lặp lại có thể dẫn đến microtears trong bản cuối. Sau khi hình thành khe hở, sự phá hủy kết thúc bởi hạt nhân pulposus (NP) có thể kích hoạt phản ứng tự miễn dịch, dẫn đến sự phát triển của MC11. Ma et al. đã chia sẻ một quan điểm tương tự và báo cáo rằng tự miễn dịch do NP đóng vai trò chính trong sinh bệnh học của MC12.
Các tế bào hệ thống miễn dịch, đặc biệt là tế bào lympho trợ giúp CD4+ T, đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của tự miễn dịch13. Tập hợp Th17 được phát hiện gần đây tạo ra cytokine IL-17 tiền viêm, thúc đẩy biểu hiện chemokine và kích thích các tế bào T trong các cơ quan bị tổn thương để tạo ra IFN-14. Các tế bào Th2 cũng đóng một vai trò duy nhất trong sinh bệnh học của các phản ứng miễn dịch. Biểu hiện của IL-4 như một tế bào Th2 đại diện có thể dẫn đến hậu quả miễn dịch nghiêm trọng15.
Mặc dù nhiều nghiên cứu lâm sàng đã được thực hiện trên MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, nhưng vẫn thiếu các mô hình thử nghiệm động vật phù hợp có thể bắt chước quá trình MC thường xuyên xảy ra ở người và có thể Được sử dụng để điều tra nguyên nhân hoặc phương pháp điều trị mới như trị liệu nhắm mục tiêu. Cho đến nay, chỉ có một vài mô hình động vật của MC đã được báo cáo để nghiên cứu các cơ chế bệnh lý cơ bản.
Dựa trên lý thuyết tự miễn được đề xuất bởi Albert và MA, nghiên cứu này đã thiết lập một mô hình MC thỏ đơn giản và có thể tái tạo bằng NP tự động cấy ghép gần tấm cuối đốt sống được khoan. Các mục tiêu khác là quan sát các đặc điểm mô học của các mô hình động vật và đánh giá các cơ chế cụ thể của NP trong sự phát triển của MC. Để kết thúc này, chúng tôi sử dụng các kỹ thuật như sinh học phân tử, MRI và nghiên cứu mô học để nghiên cứu sự tiến triển của MC.
Hai con thỏ chết vì chảy máu trong khi phẫu thuật và bốn con thỏ đã chết trong quá trình gây mê trong MRI. 48 con thỏ còn lại sống sót và không có dấu hiệu hành vi hoặc thần kinh sau phẫu thuật.
MRI cho thấy cường độ tín hiệu của mô nhúng trong các lỗ khác nhau là khác nhau. Cường độ tín hiệu của thân đốt sống L5 trong nhóm NPE thay đổi dần ở 12, 16 và 20 tuần sau khi chèn (trình tự T1W cho thấy tín hiệu thấp và trình tự T2W cho thấy tín hiệu hỗn hợp cộng với tín hiệu thấp) (Hình 1c), trong khi sự xuất hiện của MRI của hai nhóm các bộ phận nhúng khác vẫn tương đối ổn định trong cùng thời gian (Hình 1A, B).
(A) MRI tuần tự đại diện của cột sống thắt lưng thỏ tại 3 điểm thời gian. Không có bất thường tín hiệu nào được tìm thấy trong hình ảnh của nhóm hoạt động giả. . . Từ khoảng thời gian 12 tuần đến khoảng thời gian 20 tuần, các tín hiệu cao lẻ tẻ xung quanh các tín hiệu thấp trong chuỗi T2W giảm.
Tăng sản xương rõ ràng có thể được nhìn thấy tại vị trí cấy ghép của cơ thể đốt sống trong nhóm NPE và tăng sản xương xảy ra nhanh hơn từ 12 đến 20 tuần (Hình 2C) cơ thể; Nhóm Sham và Nhóm ME (Hình 2C) 2A, B).
. . (C) Tăng sản xương xảy ra tại vị trí cấy ghép trong nhóm NPE. Tăng sản xương tăng lên nhanh chóng và thậm chí mở rộng qua đĩa đệm với cơ thể đốt sống đối diện.
Phân tích mô học cung cấp thông tin chi tiết hơn về sự hình thành xương. Hình 3 cho thấy các bức ảnh của các phần sau phẫu thuật được nhuộm bằng H & E. Trong nhóm hoạt động giả, các tế bào sụn được sắp xếp tốt và không phát hiện sự tăng sinh tế bào (Hình 3a). Tình hình trong nhóm ME tương tự như trong nhóm hoạt động giả (Hình 3B). Tuy nhiên, trong nhóm NPE, một số lượng lớn chondrocytes và sự tăng sinh của các tế bào giống NP đã được quan sát thấy tại vị trí cấy ghép (Hình 3);
. (B) Tình trạng của vị trí cấy ghép trong nhóm ME tương tự như nhóm giả. Trabeculae và chondrocytes có thể được nhìn thấy, nhưng không có sự tăng sinh rõ ràng tại vị trí cấy ghép (40 lần). .
Biểu hiện của interleukin 4 (IL-4) mRNA, interleukin 17 (IL-17) mRNA và interferon (IFN-γ) mRNA đã được quan sát thấy ở cả hai nhóm NPE và ME. Khi mức độ biểu hiện của các gen mục tiêu được so sánh, các biểu hiện gen của IL-4, IL-17 và IFN-đã tăng đáng kể ở nhóm NPE so với nhóm của nhóm ME và nhóm hoạt động giả (Hình 4) (P <0,05). So với nhóm hoạt động giả, mức độ biểu hiện của IL-4, IL-17 và IFN-trong nhóm ME chỉ tăng nhẹ và không đạt được thay đổi thống kê (P> 0,05).
Biểu hiện mRNA của IL-4, IL-17 và IFN- trong nhóm NPE cho thấy xu hướng cao hơn đáng kể so với các nhóm trong nhóm hoạt động giả và nhóm ME (P <0,05).
Ngược lại, mức độ biểu hiện trong nhóm ME cho thấy không có sự khác biệt đáng kể (p> 0,05).
Phân tích Western blot được thực hiện bằng cách sử dụng các kháng thể có bán trên thị trường chống lại IL-4 và IL-17 để xác nhận mẫu biểu hiện mRNA bị thay đổi. Như thể hiện trong Hình 5A, B, so với nhóm ME và nhóm hoạt động giả, mức protein của IL-4 và IL-17 trong nhóm NPE đã tăng đáng kể (P <0,05). So với nhóm hoạt động giả, mức protein của IL-4 và IL-17 trong nhóm ME cũng không đạt được những thay đổi có ý nghĩa thống kê (P> 0,05).
. (B) Biểu đồ blot phương Tây.
Do số lượng mẫu của con người hạn chế thu được trong quá trình phẫu thuật, các nghiên cứu rõ ràng và chi tiết về sinh bệnh học của MC có phần khó khăn. Chúng tôi đã cố gắng thiết lập một mô hình động vật của MC để nghiên cứu các cơ chế bệnh lý tiềm năng của nó. Đồng thời, đánh giá X quang, đánh giá mô học và đánh giá sinh học phân tử đã được sử dụng để tuân theo quá trình MC gây ra bởi Autograft NP. Kết quả là, mô hình cấy NP dẫn đến sự thay đổi dần dần về cường độ tín hiệu từ các điểm thời gian từ 12 tuần đến 20 tuần (tín hiệu thấp trong chuỗi T1W và tín hiệu thấp trong chuỗi T2W), cho thấy sự thay đổi mô và phân tử và phân tử mô học Đánh giá sinh học đã xác nhận kết quả của nghiên cứu X quang.
Kết quả của thí nghiệm này cho thấy những thay đổi thị giác và mô học xảy ra tại vị trí vi phạm cơ thể đốt sống trong nhóm NPE. Đồng thời, sự biểu hiện của các gen IL-4, IL-17 và IFN-, cũng như IL-4, IL-17 và IFN- đã được quan sát Cơ thể có thể gây ra một loạt các thay đổi tín hiệu và hình thái. Thật dễ dàng để thấy rằng các đặc tính tín hiệu của các thân đốt sống của mô hình động vật (tín hiệu thấp trong chuỗi T1W, tín hiệu hỗn hợp và tín hiệu thấp trong chuỗi T2W) rất giống với các tế bào đốt sống của con người và các đặc tính MRI cũng Xác nhận các quan sát về mô học và giải phẫu tổng, nghĩa là những thay đổi trong các tế bào cơ thể đốt sống là tiến triển. Mặc dù phản ứng viêm do chấn thương cấp tính có thể xuất hiện ngay sau khi đâm thủng, kết quả MRI cho thấy sự thay đổi tín hiệu tăng dần đã xuất hiện 12 tuần sau khi bị đâm và tồn tại đến 20 tuần mà không có bất kỳ dấu hiệu phục hồi hoặc đảo ngược MRI nào. Những kết quả này cho thấy NP đốt sống tự thân là một phương pháp đáng tin cậy để thiết lập MV tiến bộ ở thỏ.
Mô hình đâm thủng này đòi hỏi kỹ năng, thời gian và nỗ lực phẫu thuật đầy đủ. Trong các thí nghiệm sơ bộ, mổ xẻ hoặc kích thích quá mức các cấu trúc dây chằng paravertebral có thể dẫn đến sự hình thành các tế bào xương đốt sống. Cần chú ý không làm hỏng hoặc kích thích các đĩa liền kề. Vì độ sâu thâm nhập phải được kiểm soát để có được kết quả nhất quán và có thể tái tạo, chúng tôi đã thực hiện một phích cắm bằng cách cắt bỏ vỏ của kim dài 3 mm. Sử dụng phích cắm này đảm bảo độ sâu khoan đồng đều trong thân đốt sống. Trong các thí nghiệm sơ bộ, ba bác sĩ phẫu thuật chỉnh hình liên quan đến hoạt động đã tìm thấy kim tiêm 16 thước dễ làm việc với kim 18-đo hoặc các phương pháp khác. Để tránh chảy máu quá nhiều trong quá trình khoan, giữ kim tĩnh trong một thời gian sẽ cung cấp một lỗ chèn phù hợp hơn, cho thấy rằng một mức độ MC nhất định có thể được kiểm soát theo cách này.
Mặc dù nhiều nghiên cứu đã nhắm mục tiêu MC, nhưng rất ít người biết về nguyên nhân và sinh bệnh học của MC25,26,27. Dựa trên các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi thấy rằng tự miễn dịch đóng vai trò chính trong sự xuất hiện và phát triển của MC12. Nghiên cứu này đã kiểm tra biểu hiện định lượng của IL-4, IL-17 và IFN-, là con đường biệt hóa chính của các tế bào CD4+ sau khi kích thích kháng nguyên. Trong nghiên cứu của chúng tôi, so với nhóm âm, nhóm NPE có biểu hiện cao hơn của IL-4, IL-17 và IFN-và mức protein của IL-4 và IL-17 cũng cao hơn.
Trên lâm sàng, biểu hiện mRNA IL-17 được tăng lên trong các tế bào NP từ bệnh nhân thoát vị đĩa đệm28. Mức độ biểu hiện IL-4 và IFN-tăng cũng được tìm thấy trong mô hình thoát vị đĩa đệm không gây ấn tượng cấp tính so với các đối chứng lành mạnh29. IL-17 đóng vai trò chính trong tình trạng viêm, chấn thương mô trong các bệnh tự miễn30 và tăng cường đáp ứng miễn dịch với IFN-31. Chấn thương mô qua trung gian IL-17 được tăng cường đã được báo cáo ở chuột MRL/LPR32 và chuột có thể tự miễn dịch. IL-4 có thể ức chế sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm (như IL-1β và TNFα) và kích hoạt đại thực bào34. Nó đã được báo cáo rằng biểu hiện mRNA của IL-4 là khác nhau ở nhóm NPE so với IL-17 và IFN-cùng thời điểm; Biểu hiện mRNA của IFN- trong nhóm NPE cao hơn đáng kể so với các nhóm khác. Do đó, sản xuất IFN- có thể là một trung gian của phản ứng viêm gây ra bởi sự xen kẽ NP. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng IFN-được sản xuất bởi nhiều loại tế bào, bao gồm các tế bào T trợ giúp loại 1 được kích hoạt, tế bào giết người tự nhiên và đại thực bào35,36, và là một cytokine gây viêm chính thúc đẩy phản ứng miễn dịch37.
Nghiên cứu này cho thấy phản ứng tự miễn có thể liên quan đến sự xuất hiện và phát triển của MC. Luoma et al. nhận thấy rằng các đặc điểm tín hiệu của MC và NP nổi bật tương tự trên MRI và cả hai đều hiển thị tín hiệu cao trong chuỗi T2W38. Một số cytokine đã được xác nhận có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện của MC, chẳng hạn như IL-139. Ma et al. cho rằng sự nhô ra của NP lên hoặc hướng xuống có thể có ảnh hưởng lớn đến sự xuất hiện và phát triển của MC12. Bobechko40 và Herzbein et al.41 đã báo cáo rằng NP là một mô miễn dịch không thể xâm nhập vào tuần hoàn mạch máu từ khi sinh ra. Các phần nhô ra của NP giới thiệu các cơ quan nước ngoài vào nguồn cung cấp máu, do đó làm trung gian cho các phản ứng tự miễn dịch tại địa phương42. Phản ứng tự miễn có thể gây ra một số lượng lớn các yếu tố miễn dịch và khi các yếu tố này liên tục tiếp xúc với các mô, chúng có thể gây ra những thay đổi trong tín hiệu43. Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện quá mức của IL-4, IL-17 và IFN-là các yếu tố miễn dịch điển hình, chứng minh thêm mối quan hệ chặt chẽ giữa NP và MCS44. Mô hình động vật này tốt bắt chước đột phá NP và nhập vào tấm cuối. Quá trình này tiếp tục tiết lộ tác động của tự miễn dịch đối với MC.
Đúng như dự đoán, mô hình động vật này cung cấp cho chúng tôi một nền tảng khả thi để nghiên cứu MC. Tuy nhiên, mô hình này vẫn còn một số hạn chế: trước tiên, trong giai đoạn quan sát động vật, một số con thỏ trung gian cần phải được tiêu hóa để thử nghiệm sinh học mô học và phân tử, do đó, một số động vật rơi ra khỏi sử dụng theo thời gian. Thứ hai, mặc dù ba điểm thời gian được đặt trong nghiên cứu này, thật không may, chúng tôi chỉ mô hình hóa một loại MC (thay đổi loại I), do đó không đủ để đại diện cho quá trình phát triển bệnh của con người và cần có nhiều điểm thời gian hơn Quan sát tốt hơn tất cả các thay đổi tín hiệu. Thứ ba, những thay đổi trong cấu trúc mô thực sự có thể được thể hiện rõ ràng bằng nhuộm mô học, nhưng một số kỹ thuật chuyên dụng có thể tiết lộ tốt hơn những thay đổi cấu trúc vi mô trong mô hình này. Ví dụ, kính hiển vi ánh sáng phân cực đã được sử dụng để phân tích sự hình thành sợi xơ hóa trong các đĩa intervertebral của thỏ45. Các tác động lâu dài của NP đối với MC và kết thúc đòi hỏi phải nghiên cứu thêm.
Năm mươi bốn con thỏ trắng New Zealand (trọng lượng khoảng 2,5-3 kg, 3-3,5 tháng tuổi) được chia ngẫu nhiên thành nhóm vận hành giả, nhóm cấy cơ bắp (nhóm ME) và nhóm cấy rễ thần kinh (nhóm NPE). Tất cả các thủ tục thử nghiệm đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện Thiên Tân và các phương pháp thử nghiệm đã được thực hiện theo các hướng dẫn đã được phê duyệt.
Một số cải tiến đã được thực hiện cho kỹ thuật phẫu thuật của S. Sobajima 46. Mỗi con thỏ được đặt ở vị trí ngả bên và bề mặt trước của năm đĩa đệm thắt lưng liên tiếp (IVDS) đã được phơi bày bằng cách sử dụng phương pháp tiếp cận sau khi tiếp cận sau. Mỗi con thỏ được gây mê toàn thân (20% urethane, 5 ml/kg qua tĩnh mạch tai). Một vết rạch da dọc được thực hiện từ cạnh dưới của xương sườn đến vành chậu, 2 cm đến cơ paravertebral. Cột sống trước bên phải từ L1 đến L6 được phơi bày bằng cách mổ xẻ sắc nét và cùn của mô dưới da quá mức, mô sau phúc mạc và cơ (Hình 6A). Mức đĩa được xác định bằng cách sử dụng vành chậu làm mốc giải phẫu cho mức đĩa L5-L6. Sử dụng kim đâm 16 thước để khoan một lỗ gần tấm cuối của đốt sống L5 đến độ sâu 3 mm (Hình 6B). Sử dụng ống tiêm 5 ml để hút hạt nhân tự thân trong đĩa intervertebral L1-L2 (Hình 6C). Hủy bỏ các hạt nhân hoặc cơ bắp theo yêu cầu của mỗi nhóm. Sau khi lỗ khoan được đào sâu, chỉ khâu có thể hấp thụ được đặt trên fascia sâu, hời hợt và da, chú ý không làm hỏng mô màng đáy của cơ thể đốt sống trong khi phẫu thuật.
. (B) Sử dụng kim 16 thước để khoan một lỗ gần tấm cuối L5. (C) Các MF tự trị được thu hoạch.
Gây mê toàn thân được sử dụng với 20% urethane (5 ml/kg) được sử dụng qua tĩnh mạch tai và X quang cột sống thắt lưng được lặp lại ở 12, 16 và 20 tuần sau phẫu thuật.
Thỏ đã bị hy sinh bằng cách tiêm ketamine tiêm bắp (25,0 mg/kg) và natri pentobarbital tiêm tĩnh mạch (1,2 g/kg) sau 12, 16 và 20 tuần sau phẫu thuật. Toàn bộ cột sống đã được loại bỏ để phân tích mô học và phân tích thực đã được thực hiện. Phiên mã ngược định lượng (RT-qPCR) và phương pháp làm mờ phương Tây đã được sử dụng để phát hiện những thay đổi trong các yếu tố miễn dịch.
Các kỳ thi MRI được thực hiện ở thỏ bằng cách sử dụng nam châm lâm sàng 3.0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) được trang bị máy thu cuộn tay chân trực giao. Thỏ được gây mê bằng 20% urethane (5 ml/kg) qua tĩnh mạch tai và sau đó đặt nằm ngửa trong nam châm với vùng thắt lưng tập trung vào cuộn bề mặt tròn đường kính 5 inch (Hệ thống y tế GE). Hình ảnh định vị có trọng số T2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) đã được thu thập để xác định vị trí của đĩa thắt lưng từ L3, L4 đến L5, L6. Các lát cắt có trọng lượng mặt phẳng T2 được thu được với các cài đặt sau: Chuỗi spin-echo nhanh với thời gian lặp lại (TR) là 2200 ms và thời gian Echo (TE) là 70 ms, ma trận; trường thị giác của 260 và tám kích thích; Độ dày cắt là 2 mm, khoảng cách là 0,2 mm.
Sau khi bức ảnh cuối cùng được chụp và con thỏ cuối cùng bị giết, các đĩa nhúng, nhúng cơ và NP đã được gỡ bỏ để kiểm tra mô học. Các mô được cố định trong 10% transermed trung tính trong 1 tuần, được khử trùng bằng axit ethylenediaminetetraacetic và parafin được phân chia. Các khối mô được nhúng trong parafin và cắt thành các phần sagittal (dày 5 μm) bằng microtome. Các phần được nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H & E).
Sau khi thu thập các đĩa đệm từ thỏ trong mỗi nhóm, tổng RNA được trích xuất bằng cột Uniq-10 (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Thượng Hải Sangon, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và hệ thống phiên mã ngược của Ii (Promega Inc. , Madison, WI, Hoa Kỳ). Phiên âm ngược đã được thực hiện.
RT-QPCR được thực hiện bằng cách sử dụng Prism 7300 (Ứng dụng Biosystems Inc., USA) và SYBR Green Jump Start Taq Readymix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Khối lượng phản ứng PCR là 20 μl và chứa 1,5 μl cDNA pha loãng và 0,2 μM của mỗi mồi. Các mồi được thiết kế bởi nhà thiết kế Oligoperfect (Invitrogen, Valencia, CA) và được sản xuất bởi Nam Kinh Golden Stewart Biotech Co., Ltd. (Trung Quốc) (Bảng 1). Các điều kiện chu kỳ nhiệt sau đây đã được sử dụng: Bước kích hoạt polymerase ban đầu ở 94 ° C trong 2 phút, sau đó 40 chu kỳ 15 giây mỗi lần ở 94 ° C để biến tính mẫu, ủ trong 1 phút ở 60 ° C, mở rộng và huỳnh quang. Các phép đo được thực hiện trong 1 phút ở 72 ° C. Tất cả các mẫu được khuếch đại ba lần và giá trị trung bình được sử dụng để phân tích RT-qPCR. Dữ liệu khuếch đại được phân tích bằng FlexStation 3 (Thiết bị phân tử, Sunnyvale, CA, USA). Biểu hiện gen IL-4, IL-17 và IFN-được chuẩn hóa thành kiểm soát nội sinh (ACTB). Mức độ biểu hiện tương đối của mRNA mục tiêu được tính toán bằng phương pháp 2-ΔCT.
Tổng protein được chiết xuất từ các mô bằng cách sử dụng chất đồng nhất mô trong dung dịch đệm ly giải RIPA (chứa cocktail ức chế protease và phosphatase) và sau đó ly tâm ở 13.000 vòng / phút trong 20 phút ở 4 ° C để loại bỏ mảnh vụn mô. Năm mươi microgam protein được nạp trên mỗi làn, cách nhau 10% SDS-PAGE, và sau đó được chuyển sang màng PVDF. Chặn được thực hiện trong sữa khô 5% không béo trong nước muối tris (TBS) chứa 0,1% Tween 20 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Màng được ủ với kháng thể nguyên phát chống decorin của thỏ (pha loãng 1: 200; Boster, Wuhan, Trung Quốc) (pha loãng 1: 200; Bioss, Bắc Kinh, Trung Quốc) qua đêm ở 4 ° C và phản ứng vào ngày thứ hai; với kháng thể thứ cấp (loãng immunoglobulin G của dê ở mức pha loãng 1: 40.000) kết hợp với peroxidase horseradish (Boster, Wuhan, Trung Quốc) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Tín hiệu Western blot được phát hiện bằng cách tăng phát quang hóa trên màng phát quang sau khi chiếu xạ tia X. Để phân tích mật độ, các blots được quét và định lượng bằng phần mềm Bandscan và kết quả được biểu thị bằng tỷ lệ miễn dịch gen mục tiêu so với khả năng miễn dịch của tubulin.
Tính toán thống kê được thực hiện bằng gói phần mềm SPSS16.0 (SPSS, Hoa Kỳ). Dữ liệu được thu thập trong nghiên cứu được biểu thị bằng độ lệch trung bình ± độ lệch chuẩn (trung bình ± SD) và được phân tích bằng cách sử dụng phân tích các biện pháp lặp lại một chiều (ANOVA) để xác định sự khác biệt giữa hai nhóm. P <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
Do đó, việc thiết lập một mô hình động vật của MC bằng cách cấy NP tự trị vào cơ thể đốt sống và thực hiện quan sát vĩ mô, phân tích MRI, đánh giá mô học và phân tích sinh học phân tử có thể trở thành một công cụ quan trọng để đánh giá và hiểu các cơ chế của MC và phát triển điều trị mới can thiệp.
Cách trích dẫn bài viết này: Han, C. et al. Một mô hình động vật về những thay đổi mô -đun đã được thiết lập bằng cách cấy pulposus hạt nhân tự thân vào xương dưới màng cứng của cột sống thắt lưng. Sci. Dân biểu 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., và Boos, N. Hình ảnh cộng hưởng từ của cột sống thắt lưng: Tỷ lệ thoát vị và duy trì của đĩa đệm, nén rễ thần kinh, bất thường tấm cuối và viêm xương khớp mặt trong không có gì . tỷ lệ. X quang 209, 661 Từ666, doi: 10.1148/X quang.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS và Lebouf-Eed, K. Modic thay đổi và mối quan hệ của chúng với các phát hiện lâm sàng. Tạp chí cột sống châu Âu: Xuất bản chính thức của Hiệp hội cột sống châu Âu, Hiệp hội Biến dạng cột sống châu Âu và Hiệp hội Nghiên cứu Cột sống cổ châu Âu 15, 1312 Phản1319, DOI: 10.1007/S00586-006-0185-X (2006).
Kuisma, M., et al. Những thay đổi mô-đun ở cuối đốt sống thắt lưng: tỷ lệ lưu hành và liên kết với đau thắt lưng và đau thần kinh tọa ở lao động nam trung niên. Cột sống 32, 1116 Từ1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
De Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., và Dalinka, M. MRI của tủy xương thay đổi gần tấm cuối trong bệnh thoái hóa cột sống thắt lưng. Ajr. Tạp chí X quang Hoa Kỳ 149, 531 Từ534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, và Carter, JR Bệnh thoái hóa đĩa đệm: Đánh giá thay đổi tủy đốt sống với MRI. X quang 166, 193 Từ199, doi: 10.1148/X quang.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS và Carter, JR hình ảnh của bệnh thoái hóa đĩa đệm. X quang 168, 177 Từ186, doi: 10.1148/X quang.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Các yếu tố dự đoán của tín hiệu kết thúc Neovertebral (MODIC) thay đổi trong dân số nói chung. Tạp chí cột sống châu Âu: Xuất bản chính thức của Hiệp hội cột sống châu Âu, Hiệp hội dị tật cột sống châu Âu và Hiệp hội nghiên cứu cột sống cổ người châu Âu, Phân khu 19, 129 Ném135, DOI: 10.1007/S00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB và Mannisch, K. Modic thay đổi sau khi thoát vị đĩa đệm thắt lưng. Tạp chí cột sống châu Âu: Xuất bản chính thức của Hiệp hội cột sống châu Âu, Hiệp hội Biến dạng cột sống châu Âu và Hiệp hội Nghiên cứu Cột sống cổ châu Âu 16, 977 Ném982, DOI: 10.1007/S00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. và Kaapa, E. Thay đổi loại I Modic có thể dự đoán thoái hóa đĩa biến dạng tiến triển nhanh chóng: Một nghiên cứu triển vọng 1 năm. Tạp chí cột sống châu Âu 21, 1135 Từ1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ và FAN, SW thay đổi mô -đun: Nguyên nhân có thể và đóng góp cho thoái hóa đĩa đệm thắt lưng. Các giả thuyết y khoa 73, 930 Từ932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, Rupture đĩa nội bộ HV. Các vấn đề prolapse đĩa trong hơn 50 năm. Cột sống (Phila PA 1976) 11, 650 Từ653 (1986).
Thời gian đăng: Tháng 12-13-2024