Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt mới hơn (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Việc xây dựng mô hình động vật biến đổi modic (MC) là cơ sở quan trọng để nghiên cứu MC. Năm mươi bốn con thỏ trắng New Zealand được chia thành nhóm phẫu thuật giả, nhóm cấy cơ (nhóm ME) và nhóm cấy nhân nhầy (nhóm NPE). Ở nhóm NPE, đĩa đệm được bộc lộ bằng phương pháp phẫu thuật thắt lưng trước bên và một cây kim được sử dụng để đâm vào thân đốt sống L5 gần tấm cuối. NP được chiết ra khỏi đĩa đệm L1/2 bằng ống tiêm và tiêm vào đó. Khoan một lỗ trên xương dưới sụn. Quy trình phẫu thuật và phương pháp khoan ở nhóm cấy cơ và nhóm phẫu thuật giả cũng giống như ở nhóm cấy NP. Ở nhóm ME, một mảnh cơ được đặt vào lỗ, trong khi ở nhóm vận hành giả, không có gì được đặt vào lỗ. Sau phẫu thuật, quét MRI và xét nghiệm sinh học phân tử đã được thực hiện. Tín hiệu trong nhóm NPE đã thay đổi, nhưng không có sự thay đổi tín hiệu rõ ràng nào trong nhóm hoạt động giả mạo và nhóm ME. Quan sát mô học cho thấy quan sát thấy sự tăng sinh mô bất thường tại vị trí cấy ghép và biểu hiện IL-4, IL-17 và IFN-γ đã tăng lên trong nhóm NPE. Việc cấy NP vào xương dưới sụn có thể tạo thành mô hình động vật của MC.
Những thay đổi về thể chất (MC) là những tổn thương của các tấm đốt sống và tủy xương lân cận có thể nhìn thấy được trên hình ảnh cộng hưởng từ (MRI). Chúng khá phổ biến ở những người có các triệu chứng liên quan1. Nhiều nghiên cứu đã nhấn mạnh tầm quan trọng của MC do nó có liên quan đến chứng đau thắt lưng (LBP)2,3. de Roos và cộng sự.4 và Modic và cộng sự.5 lần đầu tiên mô tả độc lập ba loại bất thường tín hiệu dưới sụn khác nhau trong tủy xương đốt sống. Những thay đổi loại Modic I là giảm tín hiệu trên các chuỗi T1W (T1W) và tăng tín hiệu trên các chuỗi T2W (T2W). Tổn thương này bộc lộ các rãnh nứt cuối cùng và mô hạt mạch máu lân cận trong tủy xương. Những thay đổi Modic loại II cho thấy tín hiệu cao trên cả hai chuỗi T1W và T2W. Trong loại tổn thương này, có thể thấy sự phá hủy tấm cuối cũng như sự thay thế mô học bằng mỡ của tủy xương lân cận. Những thay đổi Modic loại III cho thấy tín hiệu thấp ở chuỗi T1W và T2W. Các tổn thương xơ cứng tương ứng với các tấm cuối đã được quan sát thấy6. MC được coi là bệnh lý của cột sống và có liên quan chặt chẽ với nhiều bệnh thoái hóa cột sống7,8,9.
Xem xét các dữ liệu có sẵn, một số nghiên cứu đã cung cấp những hiểu biết chi tiết về nguyên nhân và cơ chế bệnh lý của MC. Albert và cộng sự. cho rằng MC có thể là do thoát vị đĩa đệm8. Hu và cộng sự. MC được cho là do thoái hóa đĩa đệm nặng10. Kroc đã đề xuất khái niệm “đứt đĩa đệm bên trong”, cho biết chấn thương đĩa đệm lặp đi lặp lại có thể dẫn đến các vết rách nhỏ ở tấm cuối. Sau khi hình thành khe hở, sự phá hủy tấm cuối bởi nhân nhầy (NP) có thể gây ra phản ứng tự miễn dịch, điều này càng dẫn đến sự phát triển của MC11. Ma và cộng sự. đã chia sẻ quan điểm tương tự và báo cáo rằng khả năng tự miễn dịch do NP gây ra đóng vai trò chính trong cơ chế bệnh sinh của MC12.
Các tế bào của hệ thống miễn dịch, đặc biệt là tế bào lympho trợ giúp CD4+T, đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh tự miễn dịch13. Tập hợp con Th17 được phát hiện gần đây tạo ra cytokine IL-17 tiền viêm, thúc đẩy biểu hiện chemokine và kích thích tế bào T trong các cơ quan bị tổn thương sản xuất IFN-γ14. Tế bào Th2 cũng đóng một vai trò đặc biệt trong cơ chế bệnh sinh của phản ứng miễn dịch. Sự biểu hiện IL-4 như một tế bào Th2 đại diện có thể dẫn đến những hậu quả bệnh lý miễn dịch nghiêm trọng15.
Mặc dù nhiều nghiên cứu lâm sàng đã được tiến hành trên MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 nhưng vẫn còn thiếu các mô hình thí nghiệm trên động vật phù hợp có thể mô phỏng quá trình MC thường xảy ra ở người và có thể được áp dụng. được sử dụng để điều tra nguyên nhân hoặc phương pháp điều trị mới như liệu pháp nhắm mục tiêu. Cho đến nay, chỉ có một số mô hình động vật mắc MC được báo cáo để nghiên cứu các cơ chế bệnh lý cơ bản.
Dựa trên lý thuyết tự miễn dịch do Albert và Ma đề xuất, nghiên cứu này đã thiết lập một mô hình MC thỏ đơn giản và có thể tái tạo bằng cách cấy NP tự động gần tấm cuối đốt sống được khoan. Các mục tiêu khác là quan sát các đặc điểm mô học của mô hình động vật và đánh giá các cơ chế cụ thể của NP trong quá trình phát triển MC. Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi sử dụng các kỹ thuật như sinh học phân tử, MRI và nghiên cứu mô học để nghiên cứu sự tiến triển của MC.
Hai con thỏ chết vì chảy máu trong khi phẫu thuật và bốn con thỏ chết trong khi gây mê khi chụp MRI. 48 con thỏ còn lại sống sót và không có dấu hiệu về hành vi hoặc thần kinh sau phẫu thuật.
MRI cho thấy cường độ tín hiệu của mô nhúng ở các lỗ khác nhau là khác nhau. Cường độ tín hiệu của thân đốt sống L5 trong nhóm NPE thay đổi dần dần vào lúc 12, 16 và 20 tuần sau khi chèn (chuỗi T1W cho thấy tín hiệu thấp và chuỗi T2W cho thấy tín hiệu hỗn hợp cộng với tín hiệu thấp) (Hình 1C), trong khi hình ảnh MRI xuất hiện của hai nhóm bộ phận nhúng còn lại vẫn tương đối ổn định trong cùng thời gian (Hình 1A, B).
( A ) MRI tuần tự đại diện của cột sống thắt lưng thỏ ở 3 thời điểm. Không tìm thấy tín hiệu bất thường nào trong các hình ảnh của nhóm hoạt động giả mạo. (B) Các đặc điểm tín hiệu của thân đốt sống trong nhóm ME tương tự như các đặc điểm trong nhóm vận hành giả và không quan sát thấy sự thay đổi tín hiệu đáng kể nào tại vị trí gắn vào theo thời gian. (C) Trong nhóm NPE, tín hiệu thấp hiển thị rõ ràng trong chuỗi T1W, tín hiệu hỗn hợp và tín hiệu thấp hiển thị rõ ràng trong chuỗi T2W. Từ khoảng thời gian 12 tuần đến khoảng thời gian 20 tuần, các tín hiệu cao lẻ tẻ xung quanh các tín hiệu thấp trong chuỗi T2W giảm dần.
Có thể thấy rõ sự tăng sản xương tại vị trí cấy ghép của thân đốt sống trong nhóm NPE và tình trạng tăng sản xương xảy ra nhanh hơn từ 12 đến 20 tuần (Hình 2C) so với nhóm NPE, không thấy có sự thay đổi đáng kể nào ở đốt sống được mô hình hóa cơ thể; Nhóm giả tạo và nhóm ME (Hình 2C) 2A, B).
(A) Bề mặt thân đốt sống ở phần cấy ghép rất mịn, lỗ lành tốt và không có hiện tượng tăng sản ở thân đốt sống. (B) Hình dạng của vị trí được cấy ghép trong nhóm ME tương tự như trong nhóm vận hành giả và không có sự thay đổi rõ ràng nào về diện mạo của vị trí được cấy ghép theo thời gian. (C) Tăng sản xương xảy ra tại vị trí cấy ghép trong nhóm NPE. Sự tăng sản xương tăng lên nhanh chóng và thậm chí còn lan rộng qua đĩa đệm đến thân đốt sống đối diện.
Phân tích mô học cung cấp thông tin chi tiết hơn về sự hình thành xương. Hình 3 cho thấy các bức ảnh của các phần sau phẫu thuật được nhuộm bằng H&E. Trong nhóm vận hành giả, các tế bào sụn được sắp xếp hợp lý và không phát hiện thấy sự tăng sinh tế bào (Hình 3). Tình huống ở nhóm ME tương tự như tình huống ở nhóm hoạt động giả tạo (Hình 3B). Tuy nhiên, trong nhóm NPE, một số lượng lớn tế bào sụn và sự tăng sinh của các tế bào giống NP đã được quan sát thấy tại vị trí cấy ghép (Hình 3);
(A) Trabeculae có thể nhìn thấy ở gần tấm cuối, các tế bào sụn được sắp xếp gọn gàng với kích thước và hình dạng tế bào đồng đều và không tăng sinh (40 lần). (B) Tình trạng của vị trí cấy ghép trong nhóm ME tương tự như tình trạng của nhóm giả. Có thể nhìn thấy bè xương và tế bào sụn nhưng không có sự tăng sinh rõ ràng ở vị trí cấy ghép (40 lần). (B) Có thể thấy tế bào sụn và tế bào giống NP tăng sinh đáng kể, hình dạng và kích thước của tế bào sụn không đồng đều (gấp 40 lần).
Sự biểu hiện của interleukin 4 (IL-4) mRNA, interleukin 17 (IL-17) mRNA và interferon γ (IFN-γ) mRNA đã được quan sát thấy ở cả hai nhóm NPE và ME. Khi mức độ biểu hiện của gen mục tiêu được so sánh, các biểu hiện gen của IL-4, IL-17 và IFN-γ đã tăng đáng kể ở nhóm NPE so với nhóm ME và nhóm vận hành giả mạo (Hình 4) (P < 0,05). So với nhóm vận hành giả, mức độ biểu hiện IL-4, IL-17 và IFN-γ trong nhóm ME chỉ tăng nhẹ và không đạt mức thay đổi thống kê (P > 0,05).
Biểu hiện mRNA của IL-4, IL-17 và IFN-γ trong nhóm NPE cho thấy xu hướng cao hơn đáng kể so với nhóm hoạt động giả mạo và nhóm ME (P <0,05).
Ngược lại, mức độ biểu hiện ở nhóm ME không có sự khác biệt đáng kể (P>0,05).
Phân tích Western blot được thực hiện bằng cách sử dụng các kháng thể có sẵn trên thị trường chống lại IL-4 và IL-17 để xác nhận mẫu biểu hiện mRNA đã thay đổi. Như được hiển thị trong Hình 5A, B, so với nhóm ME và nhóm hoạt động giả mạo, nồng độ protein IL-4 và IL-17 trong nhóm NPE đã tăng đáng kể (P <0,05). So với nhóm vận hành giả, nồng độ protein IL-4 và IL-17 trong nhóm ME cũng không đạt được những thay đổi có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).
(A) Nồng độ protein IL-4 và IL-17 trong nhóm NPE cao hơn đáng kể so với nhóm ME và nhóm giả dược (P <0,05). (B) Biểu đồ Western blot.
Do số lượng mẫu người thu được trong quá trình phẫu thuật còn hạn chế nên các nghiên cứu rõ ràng và chi tiết về cơ chế bệnh sinh của MC có phần khó khăn. Chúng tôi đã cố gắng thiết lập một mô hình động vật của MC để nghiên cứu các cơ chế bệnh lý tiềm ẩn của nó. Đồng thời, đánh giá X quang, đánh giá mô học và đánh giá sinh học phân tử đã được sử dụng để theo dõi quá trình MC gây ra bởi quá trình ghép NP tự thân. Kết quả là, mô hình cấy NP dẫn đến sự thay đổi dần dần về cường độ tín hiệu từ các thời điểm 12 tuần đến 20 tuần (tín hiệu thấp hỗn hợp trong trình tự T1W và tín hiệu thấp trong trình tự T2W), cho thấy sự thay đổi của mô cũng như các biến đổi mô học và phân tử. đánh giá sinh học đã xác nhận kết quả của nghiên cứu X quang.
Kết quả của thí nghiệm này cho thấy những thay đổi về thị giác và mô học xảy ra tại vị trí xâm phạm thân đốt sống ở nhóm NPE. Đồng thời, quan sát thấy sự biểu hiện của các gen IL-4, IL-17 và IFN-γ cũng như IL-4, IL-17 và IFN-γ cho thấy sự xâm phạm của mô nhân nhầy tự thân ở đốt sống. cơ thể có thể gây ra một loạt các thay đổi về tín hiệu và hình thái. Dễ dàng nhận thấy rằng các đặc điểm tín hiệu của thân đốt sống của mô hình động vật (tín hiệu thấp trong chuỗi T1W, tín hiệu hỗn hợp và tín hiệu thấp trong chuỗi T2W) rất giống với các đặc điểm của tế bào đốt sống của con người và đặc điểm MRI cũng vậy. xác nhận những quan sát về mô học và giải phẫu tổng thể, nghĩa là những thay đổi trong tế bào thân đốt sống đang tiến triển. Mặc dù phản ứng viêm do chấn thương cấp tính có thể xuất hiện ngay sau khi đâm thủng, nhưng kết quả MRI cho thấy sự thay đổi tín hiệu ngày càng tăng dần xuất hiện 12 tuần sau khi đâm thủng và tồn tại đến 20 tuần mà không có bất kỳ dấu hiệu phục hồi hoặc đảo ngược thay đổi nào của MRI. Những kết quả này cho thấy NP đốt sống tự thân là một phương pháp đáng tin cậy để thiết lập MV tiến triển ở thỏ.
Mô hình đâm thủng này đòi hỏi phải có đủ kỹ năng, thời gian và nỗ lực phẫu thuật. Trong các thí nghiệm sơ bộ, việc bóc tách hoặc kích thích quá mức các cấu trúc dây chằng cạnh cột sống có thể dẫn đến hình thành gai xương đốt sống. Cần cẩn thận để không làm hỏng hoặc kích ứng các đĩa liền kề. Vì độ sâu thâm nhập phải được kiểm soát để đạt được kết quả nhất quán và có thể lặp lại, nên chúng tôi đã tạo nút chặn theo cách thủ công bằng cách cắt vỏ của một chiếc kim dài 3 mm. Sử dụng phích cắm này đảm bảo độ sâu khoan đồng đều trong thân đốt sống. Trong các thí nghiệm sơ bộ, ba bác sĩ phẫu thuật chỉnh hình tham gia vào ca phẫu thuật nhận thấy kim 16 thước dễ thao tác hơn kim 18 thước hoặc các phương pháp khác. Để tránh chảy máu quá nhiều trong quá trình khoan, việc giữ yên kim trong một thời gian sẽ tạo ra lỗ đưa phù hợp hơn, cho thấy rằng có thể kiểm soát một mức MC nhất định theo cách này.
Mặc dù nhiều nghiên cứu nhắm vào MC nhưng người ta biết rất ít về nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh của MC25,26,27. Dựa trên các nghiên cứu trước đây, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng tự miễn dịch đóng vai trò chính trong sự xuất hiện và phát triển của MC12. Nghiên cứu này kiểm tra sự biểu hiện định lượng của IL-4, IL-17 và IFN-γ, đây là những con đường biệt hóa chính của tế bào CD4+ sau khi kích thích kháng nguyên. Trong nghiên cứu của chúng tôi, so với nhóm âm tính, nhóm NPE có biểu hiện IL-4, IL-17 và IFN-γ cao hơn, đồng thời nồng độ protein IL-4 và IL-17 cũng cao hơn.
Trên lâm sàng, biểu hiện IL-17 mRNA tăng lên trong tế bào NP ở bệnh nhân thoát vị đĩa đệm28. Mức độ biểu hiện IL-4 và IFN-γ tăng lên cũng được tìm thấy trong mô hình thoát vị đĩa đệm không do nén cấp tính so với nhóm đối chứng khỏe mạnh29. IL-17 đóng vai trò chính trong tình trạng viêm, tổn thương mô trong các bệnh tự miễn30 và tăng cường đáp ứng miễn dịch với IFN-γ31. Tổn thương mô qua trung gian IL-17 tăng cường đã được báo cáo ở chuột MRL/lpr32 và chuột nhạy cảm với bệnh tự miễn dịch33. IL-4 có thể ức chế sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm (như IL-1β và TNFα) và kích hoạt đại thực bào34. Có báo cáo rằng biểu hiện mRNA của IL-4 ở nhóm NPE khác với IL-17 và IFN-γ ở cùng thời điểm; Biểu hiện mRNA của IFN-γ trong nhóm NPE cao hơn đáng kể so với các nhóm khác. Do đó, việc sản xuất IFN-γ có thể là chất trung gian của phản ứng viêm gây ra bởi sự xen kẽ NP. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng IFN-γ được sản xuất bởi nhiều loại tế bào, bao gồm tế bào T trợ giúp loại 1 đã được kích hoạt, tế bào giết người tự nhiên và đại thực bào35,36, và là một cytokine gây viêm quan trọng giúp thúc đẩy phản ứng miễn dịch37.
Nghiên cứu này cho thấy phản ứng tự miễn dịch có thể liên quan đến sự xuất hiện và phát triển của MC. Luoma và cộng sự. nhận thấy rằng các đặc tính tín hiệu của MC và NP nổi bật là tương tự nhau trên MRI và cả hai đều hiển thị tín hiệu cao trong chuỗi T2W38. Một số cytokine đã được xác nhận có liên quan chặt chẽ đến sự xuất hiện của MC, chẳng hạn như IL-139. Ma và cộng sự. cho rằng sự nhô lên hoặc nhô xuống của NP có thể ảnh hưởng lớn đến sự xuất hiện và phát triển của MC12. Bobechko40 và Herzbein et al.41 đã báo cáo rằng NP là một mô có khả năng miễn dịch không thể xâm nhập vào tuần hoàn mạch máu từ khi sinh ra. Các phần nhô ra của NP đưa các vật thể lạ vào nguồn cung cấp máu, từ đó làm trung gian cho các phản ứng tự miễn dịch cục bộ42. Phản ứng tự miễn dịch có thể tạo ra một số lượng lớn các yếu tố miễn dịch và khi các yếu tố này tiếp xúc liên tục với các mô, chúng có thể gây ra những thay đổi trong tín hiệu43. Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện quá mức của IL-4, IL-17 và IFN-γ là những yếu tố miễn dịch điển hình, chứng minh thêm mối quan hệ chặt chẽ giữa NP và MC44. Mô hình động vật này bắt chước rất tốt sự đột phá của NP và đi vào tấm cuối. Quá trình này tiết lộ thêm tác động của khả năng tự miễn dịch đối với MC.
Đúng như dự đoán, mô hình động vật này cung cấp cho chúng ta một nền tảng khả thi để nghiên cứu MC. Tuy nhiên, mô hình này vẫn còn một số hạn chế: thứ nhất, trong giai đoạn quan sát động vật, một số thỏ giai đoạn trung gian cần được tiêu hủy để xét nghiệm mô học và sinh học phân tử nên một số con thỏ “không còn sử dụng” theo thời gian. Thứ hai, mặc dù ba điểm thời gian được đặt ra trong nghiên cứu này, nhưng thật không may, chúng tôi chỉ mô hình hóa một loại MC (Modic type I thay đổi), vì vậy nó không đủ để thể hiện quá trình phát triển bệnh tật ở người và cần đặt nhiều điểm thời gian hơn để quan sát tốt hơn tất cả những thay đổi tín hiệu. Thứ ba, những thay đổi trong cấu trúc mô thực sự có thể được thể hiện rõ ràng bằng phương pháp nhuộm mô học, nhưng một số kỹ thuật chuyên dụng có thể phát hiện rõ hơn những thay đổi cấu trúc vi mô trong mô hình này. Ví dụ, kính hiển vi ánh sáng phân cực được sử dụng để phân tích sự hình thành sụn sợi trong đĩa đệm của thỏ45. Tác động lâu dài của NP lên MC và tấm cuối cần được nghiên cứu thêm.
54 con thỏ trắng New Zealand đực (nặng khoảng 2,5-3 kg, 3-3,5 tháng tuổi) được chia ngẫu nhiên thành nhóm phẫu thuật giả, nhóm cấy cơ (nhóm ME) và nhóm cấy rễ thần kinh (nhóm NPE). Tất cả các quy trình thí nghiệm đã được phê duyệt bởi Ủy ban đạo đức của Bệnh viện Thiên Tân và các phương pháp thí nghiệm được thực hiện theo đúng hướng dẫn đã được phê duyệt.
Một số cải tiến đã được thực hiện đối với kỹ thuật phẫu thuật của S. Sobajima 46. Mỗi con thỏ được đặt ở tư thế nằm nghiêng và bề mặt trước của năm đĩa đệm thắt lưng liên tiếp (IVD) được bộc lộ bằng cách sử dụng phương pháp sau phúc mạc sau phúc mạc. Mỗi con thỏ được gây mê toàn thân (urethane 20%, 5 ml/kg qua tĩnh mạch tai). Một vết rạch da dọc được thực hiện từ mép dưới của xương sườn đến vành chậu, cách bụng 2 cm đến cơ cạnh cột sống. Cột sống trước bên phải từ L1 đến L6 được bộc lộ bằng cách bóc tách sắc nét và cùn các mô dưới da phía trên, mô sau phúc mạc và cơ (Hình 6A). Mức độ đĩa đệm được xác định bằng cách sử dụng vành chậu làm mốc giải phẫu cho mức độ đĩa đệm L5-L6. Dùng kim đâm cỡ 16 để khoan một lỗ gần tấm cuối của đốt sống L5 đến độ sâu 3 mm (Hình 6B). Sử dụng ống tiêm 5 ml để hút nhân nhầy tự thân ở đĩa đệm L1-L2 (Hình 6C). Loại bỏ nhân nhầy hoặc cơ theo yêu cầu của từng nhóm. Sau khi lỗ khoan được đào sâu, các mũi khâu tự tiêu sẽ được đặt vào cân sâu, cân nông và da, chú ý không làm tổn thương mô màng xương của thân đốt sống trong quá trình phẫu thuật.
(A) Đĩa L5–L6 được bộc lộ thông qua đường tiếp cận sau phúc mạc sau bên. (B) Sử dụng kim cỡ 16 để khoan một lỗ gần tấm cuối L5. (C) MF tự thân được thu hoạch.
Gây mê toàn thân được thực hiện bằng urethane 20% (5 ml/kg) qua tĩnh mạch tai và chụp X quang cột sống thắt lưng được lặp lại sau 12, 16 và 20 tuần sau phẫu thuật.
Thỏ đã bị hy sinh bằng cách tiêm bắp ketamine (25,0 mg/kg) và tiêm tĩnh mạch natri pentobarbital (1,2 g/kg) vào lúc 12, 16 và 20 tuần sau phẫu thuật. Toàn bộ cột sống đã được cắt bỏ để phân tích mô học và phân tích thực tế đã được thực hiện. Phiên mã ngược định lượng (RT-qPCR) và phương pháp Western blot được sử dụng để phát hiện những thay đổi trong các yếu tố miễn dịch.
Kiểm tra MRI được thực hiện trên thỏ bằng nam châm lâm sàng 3.0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) được trang bị máy thu cuộn dây chi trực giao. Thỏ được gây mê bằng urethane 20% (5 mL/kg) qua tĩnh mạch tai và sau đó đặt nằm ngửa trong nam châm với vùng thắt lưng tập trung vào một cuộn dây bề mặt hình tròn đường kính 5 inch (GE Medical Systems). Hình ảnh định vị có trọng số Coronal T2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) đã được thu thập để xác định vị trí của đĩa đệm thắt lưng từ L3–L4 đến L5–L6. Các lát cắt có trọng số T2 của mặt phẳng Sagittal được thu được với các cài đặt sau: chuỗi tiếng vang quay nhanh với thời gian lặp lại (TR) là 2200 ms và thời gian tiếng vang (TE) là 70 ms, ma trận; trường thị giác 260 và tám kích thích; Độ dày cắt là 2 mm, khoảng cách là 0,2 mm.
Sau khi bức ảnh cuối cùng được chụp và con thỏ cuối cùng bị giết, các đĩa giả, gắn cơ và NP được lấy ra để kiểm tra mô học. Các mô được cố định trong formalin đệm trung tính 10% trong 1 tuần, được khử keo bằng axit ethylenediaminetetraacetic và cắt parafin. Các khối mô được nhúng trong parafin và cắt thành các phần dọc (dày 5 μm) bằng microtome. Các phần được nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H&E).
Sau khi thu thập các đĩa đệm từ thỏ trong mỗi nhóm, RNA tổng số được chiết xuất bằng cột UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và hệ thống sao chép ngược ImProm II (Promega Inc. , Madison, WI, Hoa Kỳ). Phiên âm ngược đã được thực hiện.
RT-qPCR được thực hiện bằng Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) và SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thể tích phản ứng PCR là 20 μl và chứa 1,5 μl cDNA pha loãng và 0,2 μM mỗi mồi. Sơn lót được thiết kế bởi OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) và được sản xuất bởi Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Trung Quốc) (Bảng 1). Các điều kiện chu trình nhiệt sau đây đã được sử dụng: bước kích hoạt polymerase ban đầu ở 94°C trong 2 phút, sau đó là 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ 15 giây ở 94°C để biến tính mẫu, ủ trong 1 phút ở 60°C, kéo dài và phát huỳnh quang. phép đo được thực hiện trong 1 phút ở 72°C. Tất cả các mẫu được khuếch đại ba lần và giá trị trung bình được sử dụng để phân tích RT-qPCR. Dữ liệu khuếch đại được phân tích bằng FlexStation 3 (Thiết bị phân tử, Sunnyvale, CA, Hoa Kỳ). Sự biểu hiện gen IL-4, IL-17 và IFN-γ đã được chuẩn hóa thành kiểm soát nội sinh (ACTB). Mức biểu hiện tương đối của mRNA mục tiêu được tính toán bằng phương pháp 2-ΔΔCT.
Protein tổng số được chiết xuất từ các mô bằng cách sử dụng chất đồng nhất mô trong dung dịch đệm ly giải RIPA (chứa cocktail ức chế protease và phosphatase) và sau đó ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C để loại bỏ các mảnh vụn mô. Năm mươi microgam protein được nạp vào mỗi làn, cách nhau 10% SDS-PAGE và sau đó được chuyển sang màng PVDF. Việc chặn được thực hiện trong sữa khô không béo 5% trong dung dịch muối Tris-buffered (TBS) chứa 0,1% Tween 20 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Màng này được ủ với kháng thể chính kháng Decorin của thỏ (pha loãng 1:200; Boster, Vũ Hán, Trung Quốc) (pha loãng 1:200; Bioss, Bắc Kinh, Trung Quốc) qua đêm ở 4°C và phản ứng vào ngày thứ hai; với kháng thể thứ cấp (globulin miễn dịch kháng thỏ G ở độ pha loãng 1:40.000) kết hợp với peroxidase cải ngựa (Boster, Vũ Hán, Trung Quốc) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Tín hiệu Western blot được phát hiện bằng cách tăng cường phát quang hóa học trên màng phát quang hóa học sau khi chiếu xạ tia X. Để phân tích mật độ, các vết mờ được quét và định lượng bằng phần mềm BandScan và kết quả được biểu thị bằng tỷ lệ giữa khả năng miễn dịch của gen mục tiêu và khả năng miễn dịch của tubulin.
Tính toán thống kê được thực hiện bằng gói phần mềm SPSS16.0 (SPSS, USA). Dữ liệu được thu thập trong quá trình nghiên cứu được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (trung bình ± SD) và được phân tích bằng cách sử dụng phân tích phương sai lặp lại một chiều (ANOVA) để xác định sự khác biệt giữa hai nhóm. P < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
Do đó, việc thiết lập mô hình động vật của MC bằng cách cấy NP tự thân vào thân đốt sống và thực hiện quan sát giải phẫu vĩ mô, phân tích MRI, đánh giá mô học và phân tích sinh học phân tử có thể trở thành một công cụ quan trọng để đánh giá và hiểu cơ chế của MC ở người và phát triển liệu pháp mới. sự can thiệp.
Cách trích dẫn bài viết này: Han, C. et al. Một mô hình động vật về những thay đổi Modic đã được thiết lập bằng cách cấy nhân nhầy tự thân vào xương dưới sụn của cột sống thắt lưng. Khoa học. Dân biểu 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. và Boos, N. Chụp cộng hưởng từ cột sống thắt lưng: tỷ lệ thoát vị và lưu giữ đĩa đệm, chèn ép rễ thần kinh, bất thường tấm cuối và viêm xương khớp mặt ở những tình nguyện viên không có triệu chứng . tỷ lệ. X quang 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, và Leboeuf-Eed, K. Modic thay đổi và mối quan hệ của chúng với các phát hiện lâm sàng. Tạp chí Cột sống Châu Âu: ấn phẩm chính thức của Hiệp hội Cột sống Châu Âu, Hiệp hội Biến dạng Cột sống Châu Âu và Hiệp hội Nghiên cứu Cột sống Cổ Châu Âu 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., và cộng sự. Những thay đổi vừa phải ở các tấm đốt sống thắt lưng: tỷ lệ phổ biến và mối liên quan với chứng đau thắt lưng và đau thần kinh tọa ở nam công nhân trung niên. Cột sống 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. và Dalinka, M. MRI của tủy xương thay đổi gần tấm cuối trong bệnh thoái hóa cột sống thắt lưng. AJR. Tạp chí X quang Hoa Kỳ 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ và Carter, JR Bệnh thoái hóa đĩa đệm: đánh giá sự thay đổi của tủy sống bằng MRI. X quang 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS và Carter, JR Hình ảnh bệnh thoái hóa đĩa đệm. X quang 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS và cộng sự. Các yếu tố dự đoán sự thay đổi tín hiệu của tấm cuối cột sống (Modic) trong dân số nói chung. Tạp chí cột sống châu Âu: Ấn phẩm chính thức của Hiệp hội cột sống châu Âu, Hiệp hội biến dạng cột sống châu Âu và Hiệp hội nghiên cứu cột sống cổ châu Âu, Phân khu 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB và Mannisch, K. Modic thay đổi sau thoát vị đĩa đệm thắt lưng. Tạp chí cột sống châu Âu: Ấn phẩm chính thức của Hiệp hội cột sống châu Âu, Hiệp hội biến dạng cột sống châu Âu và Hiệp hội nghiên cứu cột sống cổ châu Âu 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., và Kaapa, E. Modic thay đổi loại I có thể dự đoán thoái hóa đĩa đệm biến dạng tiến triển nhanh chóng: một nghiên cứu tiền cứu kéo dài 1 năm. Tạp chí Cột sống Châu Âu 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ và Fan, SW Modic thay đổi: nguyên nhân có thể và góp phần gây thoái hóa đĩa đệm thắt lưng. Giả thuyết y tế 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Vỡ đĩa đệm bên trong. Vấn đề sa đĩa đệm trong hơn 50 năm. Cột sống (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Thời gian đăng: 13-12-2024